Untersuchung Von Glykosylierungsleistung und Intrazellulären Nukleotidzucker-Konzentrationen Rekombinanter CHO-Zellen Unter Hypothermen Kulturbedingungen.

Intro -- 1. Theorie 1 -- 1.1. Zielsetzung der Arbeit -- 1.2. Einführung -- 1.3. Das Modellglykoprotein Erythropoietin -- 1.4. Biosynthese komplexer N-Glykane -- 1.5. Metabolismus der Nukleotidzucker -- 1.5.1. Biosynthese der UDP-Nukleotidzucker -- 1.5.2. Biosynthese von CMP-Sialinsäure -- 1.5.3. Biosynthese von GDP-Mannose und GDP-Fucose -- 1.5.4. Transport der Nukleotidzucker in Golgi und ER -- 1.6. Beinflussende Faktoren der Glykosylierung in Zellkulturprozessen -- 1.6.1. Mediumskomponenten -- 1.6.2. Prozessparameter -- 1.6.3. Glycosidasen -- 2. Material und Methoden -- 2.1. Zellkultivierung -- 2.1.1. Zelllinien -- 2.1.2. Zellkulturmedien -- 2.1.3. Kryokonservierung -- 2.1.4. Zellanzucht für Bioreaktorkultivierungen -- 2.1.5. Kultivierung in Schüttelflaschen -- 2.1.6. Kultivierung im Bioreaktor -- 2.2. Analytik der Zellkulturprozesse -- 2.2.1. Zelldichte und -viabilität -- 2.2.2. Produktkonzentration -- 2.2.3. Glucose- / Lactat-Konzentration -- 2.2.4. Ammonium-Konzentration -- 2.2.5. Aminosäure-Konzentrationen -- 2.2.6. Berechnung zellspezifischer Parameter -- 2.3. Analytik der Erythropoietin-Glykosylierung -- 2.3.1. Affinitätschromatographische Aufreinigung von Epo -- 2.3.2. Epo-Glykoisoformenanalytik -- 2.3.3. Glykananalytik -- 2.4. Präparation und Analyse intrazellulärer aktivierter Zucker und Nukleotide -- 2.4.1. Probenahme -- 2.4.2. Präparation -- 2.4.3. Ansetzen von Kalibierstandards -- 2.4.4. HPLC-Methode mit massenspektrometrischer Detektion -- 2.4.5. Kapillarzonenelektrophoretische Analyse -- 2.5. Methoden zur Untersuchung der Expression von Sialyltransferase -- 2.5.1. Probenahme und Proteinextraktion -- 2.5.2. Bestimmung der Proteinkonzentration -- 2.5.3. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese -- 2.5.4. Western Blotting mit Sialyltranferase-spezifischem Antikörper -- 3. Ergebnisse und Diskussion.

3.1. Entwicklung von Methoden zur Messung intrazellulärer Nukleotid- und Nukleotidzucker-Konzentrationen -- 3.1.1. Entwicklung einer HPLC-ESI-MS/MS-basierten Methode -- 3.1.2. Entwicklung einer kapillarzonenelektrophoretischen Methode -- 3.1.3. Untersuchungen zur Extraktion von Nukleotidzuckern und Nukleotiden -- 3.1.4. Untersuchungen zur Aufreinigung der Metabolite mittels Festphasenextraktion -- 3.1.5. Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse -- 3.2. Kultivierungen zur Untersuchung des Einflusses variierter Temperaturbedingungen -- 3.2.1. Parallelkultivierung A -- 3.2.2. Parallelkultivierungen B und C -- 3.2.3. Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse -- 3.3. Untersuchung intrazellulärer Metabolite und Enzyme des Glykosylierungsapparats für Parallelkultivierung B und C -- 3.3.1. Verlauf der Nukleotidzucker-Konzentrationen -- 3.3.2. Verlauf der Nukleotid-Konzentrationen -- 3.3.3. Untersuchung der Sialyltransferase-Expression -- 3.3.4. Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse -- 4. Zusammenfassung und Ausblick -- A. Anhang.

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